Место закладки храма, задуманного в византийском архитектурном стиле, было освящено 14 октября 1899 года архиепископом Виленским и Литовским Ювеналием (Половцевым). Основную часть денег на постройку и оборудование новой церкви составили пожертвования частных лиц, участок под храм также был подарен частным лицом – В. В. Мартинсоном, который был позже погребен в ограде церкви. Храм строился по проекту местного архитектора М. М. Прозорова. Единое целое со зданием церкви образует колокольня. Знаменская церковь – трехпрестольная. Главный престол освящен в честь иконы пресвятой Богородицы «Знамение», приделы – во имя Иоаннна Крестителя и преподномученицы Евдокии. В храме есть киот Покрова Божией Матери. Церковь была освящена 1 июня 1903 года архиепископом Ювеналием. При храме действовала церковно-приходская школа и библиотека с большим читальным залом. Во время Первой Мировой войны при храме действовал приют для детей. В 1944 году, в период наступления советских войск, Вильнюс ожесточенно бомбили, многие здания были разрушены, пострадал и храм. За неимением средств не было возможности произвести надлежащий ремонт храма.

С 1988 г. настоятелем назначен протоиерей Петр Мюллер. В 1990 году трудами настоятеля и прихожан оборудовано отопление храма с подключением от газовой системы. В 1989 г. при храме была открыта воскресная школа вероучения, зарегистрированная в отделе образования и просвещения Литовской ССР. В этом же году было закончено строительство хозяйственных построек на территории храма, а так же были оборудованы в полуподвалах два помещения для проведения занятий школы и мастерская. В начале ноября 1989 года школу православного вероучения посетил Преосвященный Епископ Антоний и благословил наши начинания. В 1990 г. в Воронеже были приобретены 4 колокола, вместо утраченных в годы Первой мировой войны. В 1994 г. организована религиозная музыкальная школа. 10 января 1995 года отдел просвещения зарегистрировал наше учебное заведение с названием «Вильнюсский музыкальный центр при православной церкви Знамения Пресвятой Богородицы и Приснодевы Марии». С 22 мая 1998 года школа зарегистрирована под наименованием «Молодёжный религиозный музыкальный учебный  центр». В мае месяце 1996 года была совершена первая обедница для заключенных в тюрьме на улице Субачаус в католической часовне. Богослужение сопровождалось пением учащихся музыкального центра. В 1997 году было изготовлено витражное паникадило для центральной части храма, а так же витражи над центральным входом «Знамение» и над вторыми дверьми церкви: образы св. пророка и предтечи Иоанна и св. преподобномученицы Евдокии, а так же Св. Духа в Кресте и на окнах Знаменской церкви. В 1998 году были построены балконы для хоров в центральном и боковых приделах. 12 декабря 1999 года в Знаменской церкви состоялось торжество, посвященное 10-летию приходской школы, 5-летию музыкального учебного молодежного центра и 100-летию освящения места закладки храма. 28 ноября 2002 года было приобретено для Знаменской церкви в центральный придел постоянное деревянное облачение для престола с резьбой по дереву и металлической чеканкой, Напрестольное Евангелие, две новые Дарохранительницы и несколько подсвечников, облачений для священнослужителей из Софринских мастерских. По Благословению Владыки Хризостома и по приглашению организаторов первого международного фестиваля православной музыки в Болгарии, с 9 по 13 июня 2004 года молодежный религиозный хор Знаменской церкви принял участие в этом культурном мероприятии. В 2005 году настоятель храма пригласил представителей из «Росреставрации» для определения состояния куполов, кровли и конструкций крыши нашего храма. С 3 октября по 6 октября 2005 году была проведена инспекция. 5 апреля 2007 года от департамента культуры при Министерстве Культуры в Литве было получено разрешение совершить ремонтные работы. Под непосредственным руководством правящего митрополита Хризостома в 2007-2009 гг. был произведен капитальный ремонт, основательная реставрация изнутри и снаружи на средства митрополита Хризостома. Для материальной поддержки расходов на ремонт также активно участвовали двое прихожан нашего храма – Лилия Беззуб и Виктор Рубахин, который оплатил работы по замене всех 60-ти окон храма. 8 октября 2008 года были освящены новые ажурные кресты для нашего храма и подняты на шпили нашей церкви. В 2009 году были изготовлены новая паперть при входе в храм из природного гранита, построены ступени и пандус для инвалидов, а также новая ограда. 5 декабря 2009 года был совершен торжественный благодарственный молебен в связи с окончанием капитального ремонта нашего храма. В 2010 году отремонтирована внутренняя часть колокольни, оборудованы на 3-ех уровнях помещения для мастерской, ризницы и библиотеки. Заново изготовлен настил пола на колокольне. 9 марта 2011 года состоялась первая встреча наших прихожан и причта в Знаменской церкви с Высокопреосвященным Архиепископом Иннокентием, Владыка прочитал третью часть Великого Канона Андрея Критского. 28 мая 2011 года состоялось Пасхальное Торжество, посвященное 15-летию Вильнюсского Знаменского молодежного религиозного музыкального учебного центра и 22-летию Воскресной школы. На торжестве присутствовал Высокопреосвященнейший Архиепископ Виленский и Литовский Иннокентий, он обратился ко всем с Пасхальным приветствием и благословил присутствующих. В 2012 году вместо устаревшей электрической инсталляции поставлена новая на средства прихожан. В 2013 году вместо украденных медных водосточных труб, установлены новые пластмассовые трубы. В 2013 году установлена сигнализация в храме и система наблюдения (8 камер) на территории церкви за счет жертвователей семьи Олизаренко. В 2015 году проведен косметический ремонт главного придела храма. В 2015 году в феврале хор Знаменской церкви принял участие в международном фестивале-конкурсе православных песнопений «Коложский Благовест» в Гродно, где был награжден дипломом III степени и званием лауреата. В 2015 году была произведена реставрация старинных киотов. Жертва семьи настоятеля.